Terapia génica lentiviral en ratones SCA3: Seguridad a largo plazo

Escrito por la Dra. Ambika Tewari Editado por la Dra. Hayley McLoughlin. Publicado inicialmente en el 6 de agosto de 2021. Traducción al español fueron hechas por FEDAES.

La expresión lentiviral de un ARNhc contra ataxina-3 fue bien tolerada y no produjo efectos adversos medibles en ratones de tipo salvaje.

La evaluación del perfil de seguridad es un paso necesario y crucial para calificar una terapia para su uso en pacientes. La terapia génica es una técnica experimental que ha demostrado un enorme progreso en el tratamiento o la reversión de una enfermedad, específicamente los trastornos monogénicos.

Es importante investigar con detenimiento la seguridad y la tolerancia de la terapia génica para evaluar su idoneidad para los ensayos clínicos. Las herramientas de terapia génica se pueden utilizar de diferentes maneras para lograr el mismo efecto terapéutico: el gen defectuoso se puede reemplazar con una copia sana, el gen mutado se puede reparar o la copia mutante del gen se puede silenciar.

La ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) o enfermedad de Machado-Joseph (MJD) causa una pérdida progresiva de neuronas en la médula espinal y en varias regiones del cerebro. Esto incluye el cerebelo, tronco encefálico, cuerpo estriado y sustancia negra. Estas neuronas tienen funciones cruciales. Sin estas neuronas, los pacientes experimentan descoordinación motora, pérdida del equilibrio y, en casos graves, muerte prematura.

Si bien se sigue logrando un gran progreso en la comprensión de cómo una mutación en un solo gen, Ataxin-3, causa los síntomas de SCA3, todavía no existe un tratamiento para detener la progresión de la enfermedad. Como trastorno monogénico, SCA3, al igual que otras ataxias espinocerebelosas (SCA), es un candidato prometedor para la terapia génica. Si bien aún no existen terapias génicas aprobadas para la SCA, existen varios laboratorios de investigación y empresas que trabajan para lograr este objetivo.

An artist's drawing of scientists standing infront of a giant piece of DNA and drugs
Este es un momento verdaderamente emocionante para la terapia génica, pero también es importante mantener la seguridad de los pacientes como una prioridad absoluta. Foto utilizada bajo licencia por Visual Generation / Shutterstock.com .

Los investigadores de este estudio han estado trabajando en la terapia génica para SCA3 desde 2008. Han investigado cómo la terapia génica podría ofrecer protección contra una mayor disminución, en varios modelos de células y ratones de SCA3. Utilizaron un enfoque en el que disminuyeron los niveles del gen Ataxin-3 mutante mientras dejaban intacto el gen Ataxin-3 normal. Esto se conoce como focalización específica de alelos. Demostraron que utilizando esta técnica, podrían reducir significativamente los cambios de comportamiento y neuropatológicos que ocurren en ratones SCA3. Los ratones tratados con la terapia génica mostraron mejoras en su equilibrio y coordinación motora.

La terapia génica en su forma más básica involucra dos componentes, el gen que reemplazará o eliminará el gen enfermo y un vector que transportará este nuevo gen a su sitio de acción. Los vectores más comúnmente utilizados en la actualidad son los virus adenoasociados (AAV) seguidos por los retrovirus. Estos virus se han diseñado específicamente para llevar a su pasajero a la ubicación especificada. Si bien ambos vectores han pasado por varios años de pruebas preclínicas y clínicas para numerosos candidatos a terapia génica, quedan preguntas sobre su seguridad. (1) ¿El producto de terapia génica continúa expresándose en el área objetivo a largo plazo? (2) Si hay expresión a largo plazo, ¿causa algún efecto adverso mensurable en el área objetivo? (3) ¿La expresión a largo plazo afecta el funcionamiento normal de las células / órganos diana?

En este estudio actual, los investigadores probaron sistemáticamente la seguridad de reducir los niveles de Ataxin-3 mutante específicamente en el cuerpo estriado de ratones adultos de tipo salvaje. El gen, un ARN en horquilla corto (ARNhc) que reduce el nivel de la proteína ataxina-3 mutante, se empaquetó en un vector. El vector utilizado en este estudio es un lentivirus. Este es un tipo de retrovirus que infecta las células que no se dividen, como las neuronas del cerebro. Por lo tanto, cuando el vector lentivirus se inyecta en el cerebro, transporta su carga de ARNhc a las neuronas.

Como control experimental, este estudio utilizó tanto ratones que no fueron inyectados como ratones inyectados con una sustancia inerte en las mismas dos ubicaciones que el shRNA. Dado que los ratones de tipo salvaje no expresan ataxina-3 mutada, este estudio solo analiza los efectos a largo plazo de expresar el lentivirus con el ARNhc.

En tres puntos de tiempo diferentes (2, 8 y 20 semanas después de la inyección o administración del vector y su carga de ARNhc) se sacrificaron los ratones. Luego, se recolectaron y analizaron sus cerebros. Una característica importante de cualquier producto de terapia génica es su perfil de expresión. Esto incluye información como su distribución tisular hasta la duración de su expresión. El ARNhc contra la ataxina-3 mutante contenía un informador. Este informe permitiría identificar cualquier célula con ARNhc al final del estudio en vida. Los cerebros se seccionaron en rodajas muy delgadas para que las proteínas específicas de las células pudieran marcarse con el uso de anticuerpos. A las 2 semanas, algunas células expresaron la proteína informadora, y la expresión aumentó progresivamente a las 8 semanas e incluso más a las 20 semanas después de la entrega del gen. Estos datos mostraron una expresión estable y a largo plazo del ARNhc.

Una preocupación en la terapia génica es si la expresión a largo plazo del gen puede inducir consecuencias desfavorables para las células del cerebro. Usando anticuerpos para marcar las proteínas neuronales, los autores encontraron que, si bien 2 semanas después de la inyección había una pérdida clara de neuronas en el lugar de la inyección, en los puntos de tiempo posteriores, esta pérdida ya no era aparente. Los autores del estudio propusieron que esta recuperación podría deberse al nacimiento de nuevas neuronas y / o al proceso de brote neuronal donde las neuronas generan ramas adicionales que hacen contacto con las neuronas vecinas.

Un factor limitante importante para la terapia génica es la respuesta inmune del huésped, que se activa cuando el cuerpo ve al nuevo vector como un invasor extraño. En este estudio, los investigadores observaron señales inflamatorias en el cerebro. La microglía y los astrocitos son dos tipos de células en el cerebro que se activan tras una lesión e inflamación. La actividad astrocítica y microglial aumentó poco después de la inyección solo en animales donde se inyectó el ARNhc contra la ataxina-3 mutante. A las 8 y 20 semanas, sus niveles volvieron a los niveles observados en los ratones no inyectados. Un tipo especial de proteínas inflamatorias, conocidas como citocinas, se elevaron después de la inyección, pero también volvieron a los niveles de control a las 20 semanas. Juntos, los resultados mostraron que incluso cuando la inflamación se desencadenó al principio del curso de la terapia, se disipó,

Este fue un estudio cuidadosamente realizado para evaluar el perfil de seguridad de un candidato a terapia génica para SCA3. En su estudio anterior de prueba de concepto, los autores demostraron que la reducción de los niveles de Ataxin-3 mutante mejoró varias características anormales en modelos de ratón SCA3. Este estudio actual muestra que el uso de este agente terapéutico en ratones de tipo salvaje es seguro hasta 20 semanas después de la administración de la terapia génica. Si bien este estudio utilizó una inyección localizada del agente de terapia génica solo en el cuerpo estriado, varias regiones del cerebro se ven afectadas en SCA3. Es necesario un estudio adicional que utilice una ruta de administración que se dirija a múltiples regiones del cerebro para evaluar el perfil de seguridad.

Son necesarios estudios futuros para caracterizar el perfil de expresión y la seguridad en primates no humanos. La vía de administración sería similar a la de los pacientes humanos, lo que permitiría que los resultados fueran más traducibles para ensayos clínicos. Este es un momento verdaderamente emocionante para la terapia génica, pero también es importante mantener la seguridad de los pacientes como una prioridad absoluta.

Términos clave

Gen: una unidad de la herencia que contiene nuestro ADN, el código que controla el desarrollo y la función de nuestro cuerpo.

Monogénico: trastorno o enfermedad involucrada o controlada por un solo gen.

Vector: un modo de transporte para llevar material genético extraño a otra célula.

ARN: ácido nucleico que transporta instrucciones del ADN para producir proteínas.

ARN en horquilla corta: un tipo de ARN plegado en una estructura en horquilla que puede apuntar a los genes y silenciarlos.

Declaración de conflicto de intereses

El autor y el editor declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Cita del artículo revisado

Nóbrega, C, et al. RNA interference therapy for Machado-Joseph Disease: Long-term safety profile of lentiviral vectors encoding short hairpin RNAs targeting mutant Ataxin-3. Human Gene Therapy, 2019. 30:7 https://doi.org/10.1089/hum.2018.157

“Expanding” the therapeutic promise for SCA1

Written by Dr. Judit M Perez Ortiz Edited by Dr. Maria do Carmo Costa

A druggable target in Spinocerebellar Ataxia type 1 (SCA1) shows promise in treating cerebellar and non-cerebellar aspects of disease.

Spinocerebellar Ataxia type 1 (SCA1) is a neurodegenerative disease that typically starts with coordination difficulties (ataxia) in mid- to late-adulthood, worsens over time, and shortens life expectancy. SCA1 runs in families, as it is caused by a genetic mutation in a gene called Ataxin-1. The gene’s instructions make a protein conveniently also termed “ataxin-1”. Healthy ataxin-1 is important in orchestrating important processes in brain cells. 

In SCA1, mutant ataxin-1 drives disease by affecting these important cellular processes. In patients with SCA1, their ataxin-1 protein has a polyglutamine repeat expansion mutation that makes the protein behave in toxic ways. The disarray caused by mutant ataxin-1 protein slowly deteriorates and ultimately compromises the health of the brain areas involved. Research on this topic is very rich and increasingly exciting. SCA1 treatments under investigation explore different strategies to minimize the insult caused by mutant ataxin-1.

New work by Nitschke and colleagues takes previous efforts a step further towards this goal by delving deeper into the promises and limitations of an exciting therapeutic “angle” in the ataxin-1 protein itself.

Experimental mice are placed on the rotating rod to animal test in the Laboratory
Research in SCA1 mice shows preventing S776 phosphorylation improved muscle strength, respiratory function, and prolonged lifespan. Photo used under license by unoL/Shutterstock.com.
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Snapshot: What is Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS)?

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) is a non-invasive method of brain stimulation. It promotes or inhibits activities in specific parts of the brain. tDCS is an experimental treatment that has been shown to result in changes in motor, cognitive and behavioural activities. It may be a valuable tool for the treatment of neurological disorders including cerebellar ataxia.

How it works

Neurons communicate with each other is through an electrical event called the action potential. The cell membrane of neurons can create differences in the concentration of charged molecules, called ions, inside and outside the cell. This separation of ions creates a voltage called the membrane potential. When a signal needs to be transduced to other neurons, a series of voltage changes in the membrane potential called the action potential occurs. The action potential propagates along the arms of the neuron, like sending a message through the cell. Once the message reaches the end of the arm where it meets up with other neurons, the initial neuron releases its neurotransmitters that deliver the message to the next neuron. And thus, the cycle continues!

tDCS works by stimulating the neurons with a weak electrical current, through electrodes placed on the scalp of the patient. These electrodes can slightly increase or decrease the resting membrane potential. This process can make it easier or harder for an action potential to occur. This either promotes or inhibits activities in specific brain regions.

Artist's depiction fo the human brain. Electrical energy is swirling around it.
tDCS is a non-invasive method of brain stimulation that promotes or inhibits activities in specific parts of the brain. Photo used under license by Andrus Ciprian/Shutterstock.com.

Application in ataxia

Due to the ability of tDCS to reversibly modulate brain activity, clinical trials have been conducted in many neurological and psychiatric disorders. Notably, a randomized, double-blind trial in 61 patients with multiple subtypes of ataxia came to completion in March 2021. After treatment with tDCS, a significant improvement in both the motor and cognitive symptoms of ataxia was observed. Patients also self-reported improvement in quality of life. The clinical assessment for motor functions was done through the scale for the assessment and rating of ataxia and the international cooperative ataxia rating scale. Assessment for cognitive functions was done through the cerebellar cognitive affective syndrome scale.

The study found that patients who went through two repeated treatment sessions with ten weeks in between had significantly better improvement when compared to patients who went through only one session of treatment. Also, the improvements persisted on average 3 to 6 months post-treatment. This means that the benefits of tDCS might last longer than previously thought.

Risks and benefits

TDCS is considered non-invasive and since its initial application in 1998, no serious or ongoing side effects have been reported. Studies have also shown that the electrical current will not interfere with vital functions of the heart and the brain stem. However, tDCS is still in its infancy. More research needs to be conducted to improve our understanding of potential risks and benefits. Temporary side effects including a mild burning/itching sensation at the stimulation sites, headache, and moderate fatigue were reported in around 17% of the patients. On the flip side, the technique uses equipment that is available on the market for other medical purposes. This makes the procedure relatively inexpensive, easily administered, and using easily replaceable equipment. TDCS could also be used in combination with other treatment methods. However, more research on combination treatments needs to be conducted to test safety and effectiveness.

If you would like to learn more about Transcranial Direct Current Stimulation, take a look at these resources by Johns Hopkins Medicine and Neuromodec.

Snapshot written by Christina (Yi) Peng and edited by Dr. David Bushart.

Snapshot: What is Riluzole?

Riluzole, often sold under the trade name Rilutek, is a medication used for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). ALS is a fatal neurodegenerative disease that mainly affects neurons controlling muscle movements. The drug was approved by the FDA (1995), Health Canada (1997), and the European Commission (1996). It helps slow down disease progression and may extend patient survival. The medication is available in tablet and liquid form, generally well-tolerated. There are sometimes mild side effects, which may include loss of appetite, nausea, and abdominal pain.

Close up of a woman taking a pill with water
Riluzole has been used to treat ALS, and research has suggested it may also help with forms of ataxia. It is currently being tested in clinical trials. Photo used under license by fizkes/Shutterstock.com.

How does it work?

Exactly how Riluzole slows disease progression remains unknown. However, it is thought that its neuroprotective effects likely stem from reducing a phenomenon known as excitotoxicity.

Neurons communicate with each other through chemical messengers called neurotransmitters. The signalling of these messengers needs to be tightly controlled. Too little or too much signaling will disrupt normal functions of the brain and cause damage to cells. Excitotoxicity is the result of excessive signaling by glutamate, one of the most abundant neurotransmitters in the brain. Glutamate is also associated with many neurodegenerative diseases.

Riluzole prevents this excessive signaling through several mechanisms. It is hypothesized that the effectiveness of riluzole in ALS treatment is the result of this neuroprotective property.

Riluzole for Ataxia

The neuroprotective function of riluzole has been a point of interest for the treatment of other neurodegenerative diseases since its approval. Multiple clinical trials have been conducted for patients with neurodegenerative diseases including Parkinson’s disease, Huntington’s disease, multiple system atrophy, and ataxia.

In 2010, a pilot trial was conducted with 40 patients with cerebellar ataxia who showed a lower level of motor impairment, measured by the International Cooperative Ataxia Rating Scale. A follow-up trial was then performed in 2015 for 55 patients with spinocerebellar ataxia (SCA) or Friedreich’s ataxia. Similarly, patient impairment had improved by an alternative measurement using the Scale for the Assessment and Rating of Ataxia. These findings indicate the possibility of riluzole being an effective treatment for cerebellar ataxia. However, more long-term studies and ones that are specific to different types of SCA need to be conducted to confirm the results.

Riluzole in Development

Even though riluzole was discovered more than 25 years ago, variations of the drug are still under development. As ALS often affects a patient’s ability to swallow, a new formulation of riluzole that is absorbed by placing it under your tongue is being developed under the name Nurtec.

Another prodrug version of riluzole, named Troriluzole (BHV-4157), may be better absorbed by the body with fewer side effects. Troriluzole is currently in phase three clinical trial for patients with different types of SCA. The trial is expected to be complete by November 30, 2021, and will hopefully provide more insight into the effectiveness of Troriluzole in SCA patients.

If you would like to learn more about Riluzole, take a look at these resources by the ClinicalTrials.gov and the Mayo Clinic.

Snapshot written by Christina (Yi) Peng and edited by Terry Suk.

Spotlight: The Cvetanovic Lab

Principal Investigator: Dr. Marija Cvetanovic

Location: University of Minnesota, Minneapolis, USA

Year Founded:  2012

What disease areas do you research?

What models and techniques do you use?

Group picture of 11 people in casual clothing.
This is a group picture of the Cvetanovic Lab from 2021. Back Row from the left to right: Katherine Hamel, Alyssa Soles, Marija Cvetanovic (PI), Austin Dellafosse, Kaelin Sbrocco, and Carrie Sheeler. Front Row from left to right: Laurel Schuck, Ella Borgenheimer, Genevieve Benjamin, Juao-Guilherme Rosa, and Fares Ghannoum. Not Pictured: Stephen Gilliat.

Research Focus

What is your research about?

The human brain is made up of many different types of cells. Each of them has slightly different roles in a healthy brain. The goal of our research is to understand how SCA1 makes these different cells sick in different ways. We want to check if different parts of the brain show distinct or unique changes because of SCA1.

We are also interested in identifying which physical changes in the brain lead to specific SCA1 symptoms. We do a lot of our research on a specific type of brain cell called glial cells.

Why do you do this research?

Most brain research focus on neurons. But 50% of the cells in your brain aren’t neurons, they are glial cells! Glial cells help support and regulate neuronal activity, but they often get overlooked. But more scientists like us are researching glial cells. They do a lot for your brain.

If we want to develop successful therapies for SCA1, we need to understand how glial cells are impacted. Without that knowledge, we will not have the full picture. That’s why we do this work.

Fun Fact

We have a number of fluffy companions in our lab. Please check the Creative Catalysts page of our Lab Website for pictures!

For More Information, check out the Cvetanovic Lab Website!


Written by Dr. Marija Cvetanovic, Edited by Celeste Suart